提取組織器官RNA|凈信多樣品組織勻漿機(jī)來實驗 返回

　　樣品組織RNA的提取實驗：這次實驗的樣品組織主要有小鼠的各個組織器官（如肝臟，肌肉，脂肪等）和人腫瘤標(biāo)本（如結(jié)直腸癌，肺癌，乳腺癌）

　　

　　1.首先要根據(jù)需要抽提的組織樣品的質(zhì)量加入相應(yīng)的TRIZOL液體，同時加入若干顆不銹鋼柱。本實驗室一般情況如下：（小鼠組織加入TRIZOL,結(jié)直腸癌標(biāo)本加入TRIZOL）

　　注意：

　　a.需事先預(yù)冷試管座

　　b.用凈信勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理時樣品體積最好不要超過TRIzol體積10℅）

　　2.把加入樣品，TRIZOL,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預(yù)冷好的試管座中。機(jī)器設(shè)置好參數(shù)蓋上蓋子，點擊運(yùn)行

　　3.機(jī)器運(yùn)行完畢后，打開蓋子，拿出凈信EP管仔細(xì)觀察組織的研磨情況，如果沒有明顯的塊狀物，那就可以進(jìn)入下一步實驗步驟，如果沒有完全打碎，還需要把EP管放入試管座中，繼續(xù)勻漿。有些堅硬，或者脂肪含量高的組織（乳腺）可能需要稍微長一點的時間，時間可以依據(jù)組織實際的研磨情況來調(diào)整勻漿時間。

　　4.和傳統(tǒng)的TRIZOL提取RNA的方法一樣，將勻漿樣品在室溫放置幾分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

　　5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩若干秒，室溫放置幾分鐘。

　　6.2-8℃10000×g離心十幾分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。

　　7.把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入異丙醇，室溫放置幾分鐘。

　　8.2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

　　9.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心幾分鐘，棄上清。

　　10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可。不要真空離心干燥，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入無RNase的水，用槍頭吸打幾次，55-60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用于酶切反應(yīng)，勿使用SDS溶液。

常見問題分析：

　　1、DNA污染：

　　A.樣品勻漿時加的試劑量太少

　　B.樣品中含有有機(jī)溶劑(如乙醇，DMSO等),強(qiáng)緩沖液或堿性溶液

　　2、得率低：

　　A.樣品裂解或勻漿處理不徹底

　　B.RNA沉淀未完全溶解

　　C.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高

　　D．樣品勻漿時加的試劑量太少

　　E．勻漿樣品時未在室溫放置幾分鐘

　　F．吸取水相時混入了有機(jī)相

　　3、RNA降解

　　A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍

　　B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

　　C.細(xì)胞在用胰酶處理時過度

　　D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理

　　E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5

預(yù)防RNase污染注意事項：

　　1．配制溶液應(yīng)使用無RNase的水

　　2．經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細(xì)菌，霉菌可能成為RNase的來源。

　　3．使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。

　　4．RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染，但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

　　本實驗已經(jīng)研磨的各個組織中發(fā)現(xiàn)肝臟組織是最容易研磨，研磨效率是最好的。

　　下圖A是RNA經(jīng)過傳統(tǒng)的液氮研磨和勻漿器研磨法抽出的RNA跑膠圖，結(jié)果很明顯發(fā)現(xiàn)這種方法是可行的，是可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的方法的。

　　

　　下圖B是利用組織勻漿器對小鼠的各個組織進(jìn)行勻漿抽出的RNA跑膠圖。發(fā)現(xiàn)在抽提各個組織的RNA的時候也是可行的。

　　

　　圖C是利用組織勻漿器對人結(jié)腸癌標(biāo)本進(jìn)行了研磨后抽提出的RNA的跑膠圖。

　　

　　圖D是小鼠的肝臟組織經(jīng)過手工研磨和機(jī)器勻漿后，最后抽提得到的RNA進(jìn)行了濃度的測定，結(jié)果說明組織勻漿器抽提出得RNA的濃度要顯著高于傳統(tǒng)的手工的方法得到的RNA。

　　

蛋白質(zhì)的提取：

　　A.根據(jù)需要抽提的組織樣品的質(zhì)量加入相應(yīng)的蛋白質(zhì)裂解液（如RIPA），同時加入3顆不銹鋼柱。（小鼠肝臟組織加入1mlRIPA蛋白裂解液，人結(jié)直腸癌組織加入500ulRIPA蛋白裂解液）

　　B.把加入樣品，蛋白裂解液，不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預(yù)冷好的試管座中。機(jī)器設(shè)置好參數(shù)蓋上蓋子，點擊運(yùn)行。

　　以下同上RNA的操作方法

　　最終所得到的蛋白質(zhì)濃度的測定經(jīng)過BCA試劑盒測定完成的，同時通過SDS-PAGE后經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色和western blot檢測都發(fā)現(xiàn)其要比傳統(tǒng)的方法更加簡便快捷，不容易引起交叉污染。

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